科研 | Science Advances:自然浮游细菌群落的公共品利用

在简单的分批培养条件下,公共品剥削者会阻碍降解物的生长,可能会减缓有机物的周转。

编译:微科盟猫猫,编辑:微科盟茗溪、江舜尧。

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导读  

细菌经常通过细胞外物质(分泌物)与环境相互作用,从而增加对有限资源的获取。这些可以充当公共品的分泌物会刺激剥削者入侵并将其“窃取”。这一现象已经在体外进行了广泛的研究,但对环境中公共品剥削者的产生和作用知之甚少。在本研究中,我们开发了一种基因组方法来系统地鉴定能够利用多糖降解过程产生公共品的细菌。本研究以几丁质(一种高度丰富的海洋生物高聚物)为重点,发现公共品剥削者在定植早期入侵且活跃在天然几丁质降解微生物群落中,可能阻碍降解。与体外研究相反,我们发现剥削者者和降解者属于遥远的谱系从而促进了它们的共存。我们的方法为利用丰富的基因组数据推断微生物之间的生态作用和相互作用开辟了新的途径

论文ID

名:Public good exploitation in natural bacterioplankton communities

自然浮游细菌群落的公共品利用

期刊:Science Advances

IF:14.136

发表时间:2021.07.28

通讯作者:Otto X. Cordero

通讯作者单位:美国麻省理工学院土木与环境工程系

DOI号:10.1126/sciadv.abi4717

实验设计

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结果

1 从基因组预测开发潜力

从理论上讲,从基因组中检测公共品剥削者应该很简单:剥削者应该缺乏公共品生产的基因(在我们的例子中是细胞外几丁质酶),但拥有允许其与生产者竞争公益的吸收和利用的遗传机制。然而,正如我们将在下面展示的那样,预测哪些生物体可以在群落中的几丁质低聚糖上生长并不是一项简单的任务。原因是,群落中对低聚糖摄取的竞争是一个复杂的特征,涉及由不同基因编码的多个过程。这些基因不一定是几丁质利用的典型途径,因为它们可以介导表面附着、生物膜形成和趋化行为,以及许多其他表型。此外,鉴于基因功能注释的局限性,特别是在研究较少的分类群中,许多生态相关基因可能缺乏预测功能。考虑到这一点,我们首先旨在确定一组基因,这些基因可以作为生物体以独立于功能注释的方式竞争几丁质降解副产物的能力的预测因子。我们推断,如果一个基因增加了生物体在几丁质低聚糖上生长的能力,那么它应该与几丁质酶“连接”,或者通过共享相似的进化历史,或者通过在染色体上共定位。

我们开发了一种计算方法来检测跨越细菌生命树的8752个非冗余完整细菌基因组中与几丁质酶共进化或共定位的基因(表S1和数据S1和S2)。基因组属于海洋和非海洋来源的分离物。为了推断共同进化,我们利用了一个事实,即基因组中几丁质酶的数量即使在近亲之间也会发生剧烈变化,范围从0到15个几丁质酶(图1A),这意味着频繁的基因增益和丢失事件。通过重建细菌生命树中3237392个基因家族的基因获得和丢失历史,并将这些历史与基因含量共同进化的无效模型(材料和方法)进行对比,我们发现了2097个与细菌中几丁质酶共同进化的基因家族(图1B)。此外,我们确定了1479个基因与基因组中的几丁质酶共定位,共有3576个候选预测基因(数据S3)。除了标准途径基因外,这些基因还具有不同的KEGG注释,如趋化性和运动性、附着和生物膜形成以及抗生素的合成,但最丰富的是未知功能和移动元件相关功能的基因,强调注释不可知方法的需要(图S1和S2以及数据S4)。几丁质酶连接的基因在我们的物种集合中具有几乎相同的存在-缺失分布(例如,同一操纵子中的两种蛋白质)进一步聚集成1905个“附属簇”,包含单个基因家族或小基因家族簇。

尽管根据定义,几丁质酶和辅助簇的得失历史是相关的,但几丁质酶的损失率高于它们共进化基因(平均优势比=1.4,t检验P<1×106,t=4.93,df=5085.7;图1C和图S3)。这意味着,在进化过程中,几丁质酶丢失但附属簇保留的事件有很多,这可能导致了低聚糖(公共品)剥削者的进化。图1D是一个例子,一个肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)菌株失去了它的几丁质酶。图1D显示,一个该菌株失去了几丁质酶,但保留了氨基糖运输和代谢所需的基因(nagABCDEKZ),以及附着和分泌纤毛(sfmCD,gsp/gspCJK),以及其他参与砷抗性(arsC),3-(3-羟基苯基)丙酸酯(3-HPP)分解作用(mhpEF),以及几个糖运输蛋白(sorBEF,manZ)有关的基因,所有这些基因都与几丁质酶共同作用。这些基因的保留可能是因为它们参与多种功能,而不仅仅是几丁质降解。然而,几丁质酶损失和辅助簇保留的结果是一种生物体的进化,这种生物体携带竞争几丁质低聚糖所需的所有基因组机制,但不产生水解酶,这与保持它们在基因组中的选择压力无关

基于这些观察结果,我们设计了一种方法,仅基于基因组数据,系统地区分降解者、剥削者和废物消费者(“清除者”)。与几丁质酶共进化的大量辅助簇为我们提供了一组可能的变量来预测生物体的表型,特别是其在几丁质低聚糖上生长的能力。假设基因组中水解酶的数量应与生物体在相应可溶性糖上生长的能力相关,我们训练了一个弹性净回归模型(材料和方法),以根据其辅助簇含量预测基因组中几丁质酶的数量。该模型分别针对每个门(材料和方法以及表S2)和1905个共进化集群进行训练;平均而言,约190个簇足以高精度预测几丁质酶的数量(平均五倍交叉验证R2=0.84;图S4和S5)。将模型(Echi)预测的几丁质酶的预期数量解释为生物体竞争几丁质低聚糖的潜力的一种度量,我们根据Echi与基因组中观察到的几丁质酶的实际数量(Ochi)之间的对比,将基因组分为降解者、剥削者或清除者。如果观察到的几丁质酶数量为零,且预期数量大于或等于1(Ochi=0和Echi≥ 1) ,我们预测该生物是一个开拓者,因为它具有典型的伴随降解物基因组中几丁质酶的遗传机制,但缺乏水解酶。如果Ochi≥ 1和Echi≥ 1,我们预计该生物体将起到降解者的作用,如果Echi<1,我们预测该生物体无法在几丁低聚糖上生长,因此如果存在于几丁质降解群落中,则必须起到废物清除者的作用(图1E)。

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图1 大规模检测与几丁质酶共进化的基因可以基于基因含量进行基因组分类。(A)一组假交替单胞菌菌株的几丁质酶拷贝数。插图显示了本研究中使用的8752个遗传上不同(ANI<99.9%)的封闭基因组的GTDB tk衍生系统发育树,每个顶端都显示了几丁质酶拷贝数(金条)。树上突出显示了主要的系统发育组;(B)一组密切相关的风疹Shewanella rubidaea菌株中几丁质酶和两个远端共进化基因的耦合增益/损失的例子;(C)丢失几丁质酶同时保留共进化基因的条件概率密度(金色),反之亦然(紫色)。计算每个共进化基因的概率,分布在所有共进化基因上;(D)一组肺炎克雷伯菌菌株,其中菌株NCTC9667丧失了所有几丁质酶,同时保留了共进化基因。Nag基因不与该组中的几丁质酶共进化,但显示出路径的完整性;(E)根据共进化基因内容进行基因组分类。根据共同进化的模式,共同进化的基因被分为若干簇。每个基因组由一个位字符串表示,该位字符串标记每个簇的存在和不存在。考虑到几丁质酶的共卷积簇含量,对所有完全测序的基因组进行线性模型训练,以预测几丁质酶的拷贝数。根据观察到的几丁质酶数量(Ochi)和预期几丁质酶数量(Echi)之间的(un)耦合,新基因组被划分为生态表型。 

2 共进化基因含量成功地预测了单一和共培养表型

在训练了我们的模型之后,我们的下一个任务是在一个自然组装的几丁质降解群体的背景下验证其预测。为此,我们利用了57个共营养海洋细菌分离物,使用顺磁性模型海洋颗粒从沿海海洋分离。虽然我们的模型没有针对这组基因组进行训练,但我们仍然能够准确预测它们的几丁质酶含量(R2=0.65,P<1×1015,df=63)。我们预测在这个集合中有16个降解者、16个剥削者和33个清除者。值得注意的是,这些功能群在系统发育上具有多样性,属于Flavobacteriales,Alteromonadales, Rhodobacterales和 Vibrionales等不同的目(图S6)。我们根据生长表型解释了我们的生态分类(降解者、剥削者和清除者),这些表型可以首先通过体外单体培养进行测试:降解者应该生长在几丁质及其单体GlcNAc上,剥削者应该生长在GlcNAc上,但不能生长在几丁质上,清除者不应在两种基质上生长(图2A和图S7)。我们将我们的预测与使用CarveMe生成的基因组级代谢模型进行了对比,CarveMe是一种最先进的工具,它基于一组普遍的、手动策划的反应,衍生出生物体特定的模型。

总体而言,我们的模型比基于注释的预测表现更好,误差减少约30%(16-22误差,Matthews相关性=0.55-0.34),证实了我们方法的价值(图S8)。关键的是,几乎所有的改进都来自于我们的模型正确预测剥削者的能力,基因组规模的代谢模型错误地将其归类为清除者(图2B和表S3)。特别是,我们发现,在预测两个相对未被研究的细菌科(黄杆菌科和互变单胞菌科)的表型时,填补空白的基因组规模代谢模型表现不佳(图2B和图S9)。这与以下观点是一致的,即依靠功能注释的模型在那些与少数已被实验表征的生物体上表现不佳,如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或霍乱弧菌。相比之下,我们的方法只需要采样足够的基因组多样性和单一的注释(在这种情况下,几丁质酶),因此可以应用于任何未培养的和注释不全的生物体。

最终,我们的预测说明了共同群落成员之间的互动。质粒编码的荧光报告使我们能够详细研究vibrio1A01(弧菌)和altero3R04(交替单胞菌)共培养的动力学,当这两个菌株以几丁质作为唯一碳源生长时。该实验表明,剥削者(alteroA3R04)仅能在降解物存在的情况下生长,以降解物的最终产量为代价,而不是以其最大生长速率为代价(图S10至S12)。这一结果促使我们检查更多的配对,以确认我们根据共培养成员的最终产量预测利用性相互作用的能力。为此,我们在含有几丁质作为唯一碳源的最小培养基中共培养了数对降解者-剥削者,此过程持续了72小时。我们使用了两种不同的降解物和三种分离物,通过我们的方法预测它们是剥削者,但通过基因组规模的代谢模型被归类为清除者。我们发现,正如预测的那样,在所有情况下,这种相互作用都是利用性的:假定的剥削者产生的菌落形成单位(CFUs)平均比单一栽培的增长多约10倍。另一方面,降解者受到剥削者的影响,其产量平均下降约6倍(图2C)。我们发现,在那些通过背叛来抑制降解物的情况下,剥削者并没有达到高产量,反之亦然。利用率和降解物产量之间的这种权衡可以用简单的消费者资源模型(包括公共品利用)来概括(图S13),这进一步支持了我们的方法能够成功预测基于注释方法失败的GlcNAc消费者(例如剥削者)。

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图2 进化引导分类预测单培养和共培养中的分离表型。(A)在几丁质及其单体N-乙酰氨基葡萄糖上生长96小时后57个海洋分离物的最终产量。通过掺入SYBR Gold DNA染料(材料和方法)发出的荧光测量产率。每个点代表至少三个生物重复的平均值。根据观察到的表型对点进行着色。a.u.任意单位。(B)使用不同的基因组信息方法进行的预测与实际观察到的表型之间的一致性。表型上,剥削者是生长在GlcNAc(>1000 a.u.)上的分离物,但不在几丁质上(<1000 a.u. )。(C)两个降解菌和三个黄细菌开发菌之间的共培养。剥削者被基因组级代谢模型错误分类,但被共进化基因含量正确分类。在以几丁质为唯一碳源的最小培养基中生长72小时。x轴表示共培养期间与单一培养期间降解物产量的倍数变化,y轴表示剥削者的数量相同。每个点代表不同的共培养,并代表两个独立复制的平均倍数变化。共培养的原始数据如表S4所示。

  3 环境中剥削者的动态

我们的体外实验结果不能保证我们假定的剥削者能够以与其声称的作用一致的方式入侵天然几丁质降解群落。为了解决这个问题,我们研究了我们的分离物在其本地海水群落中的种群动态。我们将分离物的16S核糖体RNA(rRNA)序列映射到原始富集实验的时间序列数据,在该实验中,群落从海水聚集到几丁质颗粒上244小时(图3A)。这使我们能够分析不同生态角色下每个映射隔离物的定植动力学(图3B)。我们发现,剥削者的早期定植动态更类似于降解者,而不是清除者,这与他们作为降解者寄生虫的作用是一致的。降解后不久,剥削者在连续中达到最大频率(剥削者为12至16小时,降解者为8小时),而清除者在后期演替阶段达到峰值(>80小时)(图S14)。我们发现,一些剥削者能够在早期和晚期增加频率,这意味着他们可能具有双重生态作用(图S14)。总之,这些观察结果表明,辅助基因簇(包含向GlcNAc化学转移的遗传机制)粘附在几丁质表面等是早期定植的主要决定因素,而不是几丁质酶本身。换句话说,我们的反应变量Echi应该比几丁质酶拷贝数(Ochi)更好地预测野生群落的早期定植动态。为了验证这一说法,我们计算了在群落被清除者控制之前,在组装的早期阶段每个分离物的最大定植速度(材料和方法以及图3C)。正如预期的那样,我们发现Echi比观察到的几丁质酶数量Ochi更能预测定植速度。与预测缺乏几丁质酶的基因组相比,预测含有几丁质酶的基因组的平均定植率高19倍(t检验P=0.02,t=3,df=8.03)。相比之下,编码几丁质酶的基因组与缺乏几丁质酶的基因组相比,在定植率上没有显示出显著差异(t检验P=0.37,t=0.94,df=7.8)。

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图3 剥削者动态模拟复杂自然群落中的降解者。(A)从美国马萨诸塞州Nahant采集的海水样本中采集了自然、高度多样的细菌群落,并与几丁质作为唯一碳源进行培养。定期从培养液中提取样本进行DNA提取和分离物收集;(B)与分离菌株的16S序列完全匹配的16S序列的定植动力学。根据几丁质酶连接的基因含量,分离物被分配了生态作用。每个面板显示不同生态角色的轨迹,每条线表示单个重复中单个16S序列的轨迹。如图例所示,突出显示每个角色的一个代表性菌株。早期定植窗口的定义如(4)所示。关于各应变随时间的热图,参见图S14;(C)根据预期几丁质酶数量(Echi)而不是观察到的几丁质酶数量(Ochi)对菌株进行分组,可以在早期定植者(降解者和剥削者)和晚期定植者(清除者)之间实现清晰的分离*P<0.05;不显著(NS)=P>0.3。

4 剥削者、降解者和废物清除者共存于合成群落中

在天然几丁质降解群落中,定植和生长的动力学是连续的,这意味着在单个几丁质颗粒上无法实现稳定共存。相反,降解者,剥削者和清除者可以在更大范围内稳定地共存于许多粒子(集合种群)。为了测试降解者和剥削者是否可以在一个封闭的系统中共存,以几丁质颗粒作为唯一的碳源,或者他们在资源偏好上的重叠是否会导致最终的群落崩溃,我们用从我们的分离物收集和三个不同角色中取样的44株菌株组成合成群落。根据16S序列距离[>任何一对之间的5个单核苷酸多态性(SNPs)]和稳健的预培养生长选择菌株。为了评估共存,我们连续传代共培养11个稀释生长周期(图4A和B,和数据S5),并使用三种不同的稀释因子(确定连续传代存活所需的最小生长速率)重复这些实验,以评估共存对不同生长条件(材料和方法)的稳健性。

在物种被迅速清除的短暂过渡期后,群落丰富度稳定在10到15个成员(图4C),所有稀释因子中所有三个角色共存(图4D)。在最后五次转移中,在群落丰富度达到平衡后,剥削者得到了稳定的维持,但丰富度较低,招募了大约占所有读数的10%。相比之下,食腐动物是最丰富的生态群体(20-80%),这支持了以前的研究结果,即剥削者和降解者广泛输出代谢废物。清除者和降解物的丰度由稀释因子控制,随着稀释强度的增加,降解物的相对丰度增加(图4D)。这一趋势可以解释为清除者的时间平均增长率较低的结果,清除者必须等待分泌的代谢物积累增长。

很明显,根据不同生态角色的频率,复制是可变的(图4D)。通过稀释因子和复制对群落组成进行更仔细的检查,揭示了生态作用中的不同多样性模式。在大多数群落中,降解菌主要由单一菌株pseudo3D05(Pseudoalteromonas)以及两种开发菌mariba6B07(Maribacter)和tritonA3R06(Tritonibacter)控制,而四到五种清除者共存于同一群落中。然而,也有明显的案例表明其他菌株占优势:在12个群落中,至少有4个群落中,pseudo3D05与其他降解菌以可观的丰度共存,在一个重复中被colwelD2M02(Colwellia)所取代,在另一个重复中被gilvimE3M09(Gilvimarinus)所取代,而两个剥削者中的一个似乎在更高的稀释因子下达到更高的相对丰度。不同清除者的丰度在不同的重复中以似乎随机的方式变化,尤其是在低稀释因子下(图4E)。这些不同角色的组成变化似乎是相互独立的;也就是说,不同的菌株被替换,对群落的其他部分没有明显的影响。尽管群落组成发生了变化,但这些角色还是稳定地共存,这表明降解者、剥削者和清除者代表了多糖降解群落中三个稳定的代谢位。

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图4 综合群落表现出生态作用的稳定共存,具有随机应变替换。(A)合成群落由44个代表不同系统发育群和生态类型的菌株组成(数据S5)。所有群落的初始组成都是相同的,因为它们是从相同的初始混合中取样的。群落允许生长84小时,转移11次。我们采用三种不同的稀释因子(10−1, 10−2和10−3) ,每个条件重复四次;(B)GTDB-tk生成了本实验所用菌株的系统发育树。分离表型由树梢的彩色圆圈表示。在至少一种条件下存活到实验结束的分离物以名称表示;(C)群落中存在的物种数量(丰富度)随时间的变化(以生长稀释周期的数量衡量);(D)合成群落中每个生态角色的稳态相对丰度(转移>8)。每个点代表特定时间点给定样本的总角色丰度。大圆圈表示每个角色的中间值,作为稀释系数的函数。颜色代表生态作用,如(A)所示(E) 每个条代表在最后一个时间点属于某一生态作用的所有分离物的作用标准化丰度。归一化后,具有相同作用的菌株的丰度加起来为1。

讨论

在本研究中,我们开发了一种新的计算方法,允许我们从基因组预测表型,特别是生物体作为几丁质低聚糖消费者的能力。我们方法的一个关键特征是对功能注释无关,而是建立在可以直接从基因组数据推断的进化模式上。基因组库继续以加速的速度增长,而功能注释仍然局限于从一些模式生物中学到东西,这一事实突出了我们方法的相关性和及时性。多年来,祖先基因组重建一直用于推断基因-基因协同进化,目的是扩展和指导微生物中蛋白质-蛋白质相互作用的发现。然而,本文是第一次利用这些方法来推断和验证复杂群落中微生物的生长表型及其生态。

利用这种方法,我们发现低聚糖剥削者在自然群落中大量存在,并且有可能阻碍降解,它们与降解者具有许多基因组特征,但不编码相关的水解酶。细菌进化过程中几丁质酶的频繁损失可能是细胞外水解过程中公共品释放所产生的短期进化激励的结果。反过来,对于降解者来说,剥削者的入侵可以通过酶在膜上的空间聚集或栓系,产生将公共品私有化的激励。最近的研究还表明,一些黄杆菌Flavobacteria具有“自私”的摄取模式,即长低聚物直接并入细胞内,绕过细胞外水解的需要。一种策略相对于另一种策略的相对优势以及每种策略可能更相关的条件仍然未知。然而,显而易见的是,降解者和剥削者之间的持续紧张关系似乎决定了细菌间多糖降解策略的演变,突出了微生物相互作用及其产生的进化动力学可以影响关键生态系统过程的事实,例如有机物的降

虽然与群落背叛者的概念一致,但我们认定的剥削者和背叛者之间有着重要的区别,正如群落进化文献中的典型设想:背叛者是功能缺失突变体,与野生型合作者表型相比,由于短期适应性优势,其频率增加。相比之下,多糖降解物的自然剥削者通过群落聚集过程入侵群落。因此,天然组装几丁质降解群落中的剥削者与降解者关系较远,具有不同的代谢潜力。因为属于这两个角色的生物体可以在多个表型维度上有所不同,这增加了共存的可能性,但这也使得预测种间相互作用变得更加困难。我们的体外研究表明,在简单的分批培养条件下,公共品剥削者会阻碍降解物的生长,可能会减缓有机物的周转。然而,需要进一步的工作来阐明这种常见的生态相互作用在更现实的条件下的影响,例如在流体流动和多种营养限制条件下。

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