降伏剧毒,为我所用!大牛Eric J. Nestler带你玩转神经科学中的病毒工具

病毒工具在神经系统的研究中有非常重要的作用。

病毒工具的发展在某种程度上来说表征着大脑科学的快速进展,并使光遗传学、化学遗传学、钙成像、透明脑等技术的应用成为可能。在某种程度上来说,病毒示踪工具重新定义了大脑的解剖学。但是在具体的实验中,不同病毒也有着其显著的优缺点,这使得病毒工具的选择对于中枢神经系统的研究及设计实验至关重要。

分子和细胞异质性是理解中枢神经系统的最大障碍,在神经科学研究中合理选择重组病毒至关重要。西奈山伊坎医学院神经药理学家Eric J. Nestler概括了目前神经科学研究中可用病毒方法的现状,并提出了实验选择重组病毒的关键考虑因素,并讨论了在哺乳动物神经系统中靶向细胞类型的未解决问题。

病毒介导的基因转染的关键原则

神经科学之病毒学原理

1)     病毒包装和有效载荷

病毒基因组由DNA或RNA组成,这些基因组被包装成特殊的颗粒,可以打开基因组并将其传递给细胞。“载荷”即为每个病毒颗粒携带核酸分子大小的能力,这是由病毒本身的基因组编码所决定。

此外,病毒基因组的核酸组成是病毒选择的关键初始决定因素,如腺相关病毒(AAV)和单纯疱疹病毒(HSV),经常用于Cre或Flp依赖的基因表达。

 2)   传递方式

      病毒的传递方式决定着如何让病毒携带特定的元件及基因进入神经系统并发挥相应作用。虽然通过局部注射进入中枢神经系统的病毒被限制在注射部位,但病毒颗粒可以保持局部或广泛扩散,这取决于病毒固有特性。

AAV、CAV、PRV三种病毒相比,虽然都通过局部注射来达到截然不同的目的,但其传递方式的不同也导致了完全不同的机理,大多数腺相关病毒(AAV)感染神经元胞体以表达基因产物, 而冠状病毒和PRV病毒则优先被神经末梢吸收,并从投射区逆向运输至细胞胞体,而CAV则是被去除毒性后感染轴突,并长距离逆向移动到细胞体,将有效载荷传递到神经元细胞核

3)     病毒趋向性

     病毒趋向性是病毒颗粒感染给定细胞类型的能力。这是所有病毒的一个关键特征,决定了体内哪些细胞被感染以及被传递的病毒基因组在特定组织中所发挥的作用,因此这种特征也叫作嗜性

要进入一个特定的细胞,所有的病毒必须结合到一个特定的受体上,病毒颗粒在受体的参与下通过胞吞的方式进入细胞。例如AAV很难进入不表达AAVR受体的细胞,同样的CAV进入细胞也需要细胞表达CAR受体,因此,受体在宿主组织和细胞类型上是否表达一定程度上决定了病毒的感染效力。

4)     传染性和毒性

     传染性和毒性是工具病毒两种密切相关却又截然不同的特性,在实验中往往要在两者间进行权衡,理想的病毒载体自然是高传染性以及低毒性的,许多重组病毒,如AAV、HSV、LV等,在神经科学中被用作“半惰性”载体,诱导细胞内在防御能力的下降,而那些在神经元中进行复制的病毒如RbV、PRV等则会引起细胞防御,引发致病效应,在神经元中快速复制从而在数天之内感染整个动物。

5)     基因表达差异

     病毒将其基因组传递到细胞后的基因表达是神经研究的另一个重要考虑因素,不同病毒基因组的表达动力学差异很大:一些病毒基因组表达很快,而另一些表达更慢,持续时间更长。

选择病毒时,了解这些模式以及每种病毒载体的动力学至关重要,例如,HSV适合快速和局部表达,多用于研究发育早期基因表达的短暂变化对成年个体功能结果的持久影响AAV则适合获得一种细胞类型的局部和长期表达的实验

与毒性和传染性一样,快速到达最高表达是最理想的病毒特性,但目前没有很好的办法来同时达到这个目标,因此在根据实验需求的不同时须随时进行调整。

病毒工具的功能和用途

1)     成像记录和调控神经元

直接成像观察和干扰调控是两个了解神经功能联系的重要手段,记录和操纵往往需要长时间的实验因此选择特异性强且毒性较弱的病毒至关重要,AAV即是满足这一条件的优良病毒,通过标记基因的表达、向特定靶区的投射和活动轨迹等,AAV已被有效地用于获得神经元群体的遗传途径。

2)     神经环路投射

神经网络中的结构连通性为理解神经元的功能提供了基础。为此,已经开发了许多环路映射工具,这些工具利用了野生型病毒的有利特性即优先感染神经末梢而不是细胞胞体,在细胞内顺向或逆向移动,并在突触处或附近任一方向上传播,此方法还用来绘制特定脑区内与该细胞的传入和传出连接相关的神经环路网络。

未来展望

病毒对神经科学研究来说是不可缺少的重要工具,每一种都有其独特的优势,同时也有着显著的局限性,这使得在实验所需病毒的选择上显得至关重要。

理想的重组病毒应该具有感染性强、毒性低、表达高等特性,它易于以高滴度包装、具有无限的有效载荷、递送简单且无害、能够感染所有细胞类型、但仅限于在所需的细胞类型中被激活,这也是未来病毒载体的升级方向。

【参考文献】

Alexander R. Nectow  , Eric J. Nestler;Viral tools for neuroscience,

文中所有图片均来自参考文献1.

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