Fra-1在表皮损伤中的炎症反应机制

AP-1可在氮芥损伤的小鼠皮肤中激活,并且可能参与了炎症反应。

文章信息

1.研究背景

转录因子激活蛋白(AP)-1可在氮芥(NM)损伤的小鼠皮肤中激活,并且有可能参与了炎症反应。 AP-1由Fos(c-Fos,Fos-B,Fra-1和Fra-2)和Jun(c-Jun,JunB和JunD)家族成员的同型或异型二聚体组成,关于它们的表达,位置和功能等相关信息尚不清楚。

2.方法

2.1 将小鼠暴露在氮芥,将受损皮肤组织制成石蜡标本进行免疫组学分析

2.2 将人上皮细胞(HaCaT细胞)暴露在氮芥,随后用siRNA转染

2.3 人类炎症细胞因子PCR芯片(Wcgene Biotech,中国上海)分析转染后的HaCaT细胞的基因表达谱

2.4 ELISA对IL-8进行定量

2.5 免疫共沉淀研究Fos家族成员结合的二聚体

3.结果

3.1 NM暴露后,小鼠表皮细胞质中主要表达的是Fra-1和Fra-2,而不是c-Fos和FosB

作为转录因子AP-1的成分,Fos家族成员的核位置可能是功能性AP-1的指标。Fos家族成员的不同定位模式表明,NM处理后c-Fos和FosB的核易位可能在表皮中处于活跃的转录状态。

图1. Fra-1,Fra-2,c-Fos和FosB在NM损伤的小鼠皮肤中的表达和定位。

(A)蛋白质印迹法测量NM损伤皮肤和对照组中的Fos家族成员。(B)NM暴露后1天和3天,收集受伤的小鼠皮肤和对照以进行组织学分析。IHC染色组织中的Fra-1,Fra-2,c-Fos和FosB。e,表皮;d,真皮。(C)从IHC视图至少三个随机区域捕获分析染色的程度和位置。

3.2 ERK激活促进NM诱导Fra-1和FosB的表达

ERK信号通路是Fos家族成员的关键上调因子。图2说明p-ERK激活增加了Fos家族成员的表达。

图2. (A-B) NM暴露后1天和3天,制备受伤的小鼠皮肤和对照。通过IHC或免疫印迹分别检测到p-ERK。(C)通过用DyLight 488的二抗免疫接种,可见 NM暴露后10h,HaCaT细胞中p-ERK的分布。(D,E,F)将HaCaT细胞暴露于NM,p-ERK抑制剂(U0126)或EGF使用免疫印迹检测 Fra-1, Fra-2, c-Fos和FosB。

3.3 Fra-1的损耗促进NM诱导的IL-8表达

为了探索Fra-1在NM损伤的角质形成细胞中的作用,将合成的siRNA转染到HaCaT细胞中,以使NM暴露前的Fra-1表达沉默。NM损伤的HaCaT细胞中Fra-1调节的炎性细胞因子如图3所示,Fra-1沉默使IL-8水平上升,说明Fra-1抑制IL-8表达。

图3.NM损伤的HaCaT细胞中Fra-1调节的炎性细胞因子。

(A)将转染了Fra-1 siRNA的HaCaT细胞暴露于NM 24小时,并使用免疫印迹法评估Fra-1的沉默效率。通过对Fra-1的免疫印迹分析来定量蛋白质印迹结果。 (B)在NM损伤的细胞中进行的人类炎性细胞因子PCR分析显示,Fra-1沉默后,mRNA水平增加> 2倍的基因被归类为受Fra-1负调控。(C)用siRNA转染的HaCaT细胞是否暴露于NM。24小时后,收集细胞并准备通过实时定量PCR检测IL-8 mRNA水平。(D)使用ELISA测量培养基中的IL-8水平。

3.4 c-Fos,FosB或Fra-2正向调节IL-8的生成

分别沉默其他Fos成员(c-Fos,FosB,Fra-2),进一步研究 Fos家族成员在调节IL-8产生中的作用的研究。结果表明,在c-Fos,FosB或Fra-2损耗的对照组或NM损伤的细胞中,IL-8蛋白水平显着降低。

图4.其他Fos成员对IL-8表达的调节。(A)将c-Fos,FosB和Fra-2 siRNA转染的HaCaT细胞暴露于NM中。24小时后,收获细胞并制备裂解物。通过免疫印迹检测c-Fos,FosB和Fra-2的蛋白水平。(B)HaCaT细胞中IL-8的ELISA。

3.5 Fra-1损耗增加了NM损伤的HaCaT细胞中c-Fos,FosB及其部分异二聚体的核水平

Jun家族成员(c-Jun,JunB和JunD)是IL-8转录因子,可能在NM损伤的HaCaT细胞中与Fos家族成员形成异二聚体。图5呈现了免疫共沉淀研究与Fos家族结合的异二聚体。共免疫沉淀显示,Fra-1与白细胞介素-8转录因子c-Jun、JunB和JunD形成二聚体。Fra-1耗竭增加了细胞核中的c-Fos和FosB,同时增加了c-Fos/c-Jun、c-Fos/JUn、c-Fos/JunD和FosB/JUn的异二聚体。

图5. NM暴露后对照和Fra-1沉默的HaCaT细胞中的异二聚体分析。(A)IHC检测c-Jun,JunB和JUND在NM暴露小鼠皮肤。(B)使用免疫印迹检测NM损伤的HaCaT细胞的细胞核中c-Jun,JunB和JunD的水平。(C)收集NM损伤的HaCaT细胞的总裂解物(RIPA)(10h)和对照用于Co-IP。(D)免疫印迹测定Fra-1沉默的HaCaT细胞,细胞质或细胞核中Fos家族成员的水平。(E)NM暴露10 h后,收集Fra-1耗尽的HaCaT细胞和对照的总裂解物进行Co-IP。

表1. Fra-1有无时AP-1的二聚模式

结论

在这项研究中,我们发现,氮芥损伤皮肤中,Fra-1促进了IL-8的过度表达。

下一步研究可以探索Fra-1如何调节其他炎性细胞因子,这可能加深我们对NM诱导的炎性细胞因子机制的了解。

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